Als biologischer Tracer werden die Sporen von Bacillus globigii verwendet. Sporen dieses Testbakteriums kommen natürlicherweise nicht in den biologischen Substraten vor, sie sind apathogen für Mensch und Tier, überstehen die Prozesseinwirkungen in anaeroben Behandlungsanlagen und sind problemlos nachweisbar.
4.1.1.1
VorbereitungBenötigte Materialien und Reagenzien
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Trypton-​Glucose-Bouillon (TGB),
zur Herstellung der Impfkultur von Bacillus globigii-​Sporen:
Hefeextrakt: 2,5 g,
Trypton: 5,0 g,
Glucose: 1,0 g,
Wasser (destilliert): 1 000 ml;
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Hefeextrakt-​Agar (MYA),
zur Herstellung von Bacillus globigii-​Sporen:
Pepton aus Fleisch: 10,0 g,
Hefeextrakt: 2,0 g,
Mangansulfat-​Monohydrat: 0,04 g,
Agar: 15 g,
Wasser (destilliert): 1 000 ml;
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Bacillus globigii Stammkultur,
zur Herstellung der Bacillus globigii Stammkulturen-​Sporensuspension:
Bacillus globigii (DSM No. 675 [Bac. Atrophaeus]) oder
Bacillus globigii (DSM) No. 2277 [Bac. Atrophaeus]) oder
Bacillus globigii (Stammsammlung der Universität Hohenheim);
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Zentrifuge mit einer Beschleunigung von 10 000 g.
ProbenherstellungTrypton-​Glucose-Bouillon (TGB):
Die Bouillon wird in Portionen von je 10 oder 100 ml in Prüfröhrchen gegeben. Es wird im Autoklaven sterilisiert. Nach der Sterilisation muss der pH-​Wert des Mediums 7,2 (± 0,2), gemessen bei 20 °C, betragen.Hefeextrakt-​Agar (MYA):Der Agar wird in Roux-​Flaschen oder Petrischalen gegeben. Es wird im Autoklaven sterilisiert. Nach der Sterilisation muss der pH-​Wert des Mediums 7,0 (± 0,2), gemessen bei 20 °C, betragen.Bacillus globigii Stammkulturen:Die Bacillus globigii-​Stammkulturen (Glycerinkultur, Lagerungstemperatur –80 °C) werden aufgetaut und in Trypton-​Glucose-Bouillon (TGB) bei 37 °C über 24 Stunden bebrütet.Aus der TGB-​Bouillon werden 6 ml auf MYA-​Platten übertragen; der Überstand wird abpipettiert. Die MYA-​Platten werden bei 37 (± 1) °C bebrütet. Nach dem dritten Bebrütungstag wird der Zustand der Kulturen mit Hilfe einer Sporenfärbung (z. B. Racket-​Färbung) beurteilt. Anschließend erfolgt eine weitere Inkubation der MYA-​Platten bei 30 °C über 7 bis 10 Tage. Danach werden die Kolonien von den MYA-​Platten mit 3 ml sterilem destillierten Wasser (aqua dest.) abgeschwemmt.Die gewonnene Sporensuspension wird zentrifugiert (3 000 Umdrehungen/min über 10 Minuten), der Überstand wird verworfen und das Pellet wird mit aqua dest. resuspendiert.Zur Ermittlung der Anzahl der Sporen wird die Suspension zuerst bei 75 (± 1) °C über 10 Minuten erhitzt, anschließend wird mit dem Koch´schen Oberflächenverfahren die Sporenzahl pro Milliliter Suspension festgestellt.
4.1.1.2
Durchführung der UntersuchungDer biologische Tracer wird einmalig in Form einer Sporensuspension gleichmäßig während eines Beschickungsintervalls dem Fermenter zugegeben. Es wird einer Beschickungs‑